在生命科學研究領域，細胞和微生物的培養是探索生命奧秘、攻克疾病難題的重要基礎。而培養環境的精確控制，直接關系到培養對象的生長狀態和實驗結果的準確性。博清生物科技（南京）有限公司研發生產的三氣培養箱憑借其能夠精準調控氧氣、二氧化碳和氮氣濃度，同時維持穩定溫度和濕度的特性，成為科研實驗中不可或缺的關鍵設備。本實驗將通過開展腫瘤細胞低氧培養和厭氧微生物培養兩項研究，探究三氣培養箱在不同科研場景下的實際應用效果。

一、 實驗目的

1、利用三氣培養箱模擬腫瘤組織低氧微環境，研究低氧條件對腫瘤細胞增殖、遷移及相關基因表達的影響，為腫瘤的發病機制研究和靶向治療提供理論依據。

2、借助三氣培養箱創建厭氧環境，實現厭氧微生物的分離培養與特性研究，探索厭氧微生物在生態系統物質循環和生物技術領域的潛在應用價值。

二、實驗設計

（一） 實驗材料

1、細胞與微生物：

人肺癌細胞系A549，購自細胞庫，復蘇后在常規條件下培養至對數生長期。

厭氧微生物樣本，采集自湖泊底泥，保存于厭氧運輸管中。

2、試劑：

細胞培養：RPMI 1640培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、低氧誘導因子-1α（HIF-1α）抗體、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體。

微生物培養：厭氧培養基（含酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖等成分）、刃天青指示劑（用于檢測厭氧環境）、無菌生理鹽水。

3、儀器：三氣培養箱（可精確調控O?、CO?、N?濃度，溫度控制范圍為4℃-60℃，濕度≥90%）、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機、熒光定量PCR儀、蛋白免疫印跡（Western Blot）相關設備、厭氧手套箱（輔助厭氧微生物操作）。

（二） 樣本分組與處理

1、腫瘤細胞實驗：

常氧組：將A549細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的 RPMI 1640培養基中，置于三氣培養箱，設置環境條件為21% O?、5% CO?、74% N?，37℃，濕度≥90%，每組設置6個生物學重復。

低氧組：同樣接種A549細胞，培養基成分相同，但將三氣培養箱環境條件調整為1% O?、5% CO?、94% N?，37℃，濕度≥90%，每組設置6個生物學重復。

2、厭氧微生物實驗：

將采集的湖泊底泥樣本用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，分別取10?2、10?3、10??稀釋度的菌液各0.1mL，均勻涂布于厭氧培養基平板上。

將涂布后的平板放入三氣培養箱，設置環境條件為0% O?、5% CO?、95% N?，35℃，濕度≥90%，每組平板設置3個生物學重復；同時設置需氧對照平板，放置于普通二氧化碳培養箱中培養。

三、實驗操作步驟

（一） 腫瘤細胞培養與檢測

1、細胞接種與培養：

取對數生長期的A549細胞，用胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度至5×10?個/mL，分別接種于上述兩組培養條件的6孔細胞培養板中，每孔加入2mL細胞懸液。

培養24小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照記錄；之后每隔24小時，采用細胞計數法測定細胞數量，繪制細胞生長曲線。

2、基因表達檢測：

培養72小時后，收集兩組細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，進行反轉錄合成cDNA。

利用熒光定量PCR儀，以β- actin為內參基因，檢測HIF-1α、PCNA、MMP-2等基因的表達水平，分析低氧條件對相關基因轉錄的影響。

3、蛋白表達檢測：

另取培養72小時的細胞，提取總蛋白，采用Western Blot技術檢測 HIF-1α、PCNA、MMP-2蛋白的表達量，探究低氧環境下蛋白水平的變化。

（二） 厭氧微生物培養與鑒定

1、培養過程：

將涂布好的厭氧培養基平板放入三氣培養箱后，通過觀察刃天青指示劑顏色變化確認厭氧環境建立情況（無氧時指示劑由藍色變為無色）。

培養5-7天后，觀察厭氧微生物在平板上的菌落形態、顏色、大小等特征，并與需氧對照平板進行對比。

2、微生物分離與鑒定：

挑選厭氧平板上不同形態的單菌落，采用劃線分離法進行純化，重復3-4次直至獲得純培養物。

對純化后的厭氧微生物進行16S rRNA基因擴增與測序，將測序結果與NCBI數據庫進行比對，鑒定微生物種類。

四、實驗結果分析

（一） 腫瘤細胞實驗結果

1、細胞形態與增殖：

常氧組細胞呈梭形，貼壁生長良好，細胞間連接緊密；低氧組細胞形態發生改變，部分細胞變圓，貼壁能力減弱。

細胞生長曲線顯示，低氧組細胞增殖速率明顯低于常氧組，差異具有統計學意義（P< 0.05）。

2、基因與蛋白表達：

熒光定量 PCR 結果表明，低氧組HIF-1α、MMP-2基因表達水平顯著高于常氧組（P< 0.01），而 PCNA 基因表達量降低（P<0.05）。

Western Blot 檢測結果與基因表達趨勢一致，低氧組HIF-1α、MMP-2蛋白表達上調，PCNA蛋白表達下調。

（二）厭氧微生物實驗結果

1、培養與分離：

三氣培養箱中培養的厭氧平板上，成功生長出多種形態的菌落，而需氧對照平板上幾乎無菌落生長，表明三氣培養箱創建的厭氧環境滿足微生物生長需求。

經劃線分離，共獲得5株純培養的厭氧微生物。

2、鑒定結果：

16S rRNA基因測序比對顯示，5株厭氧微生物分別屬于擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌屬（Clostridium）等不同的分類單元，為后續深入研究其功能特性奠定基礎。

五、實驗結論

本實驗通過腫瘤細胞低氧培養和厭氧微生物培養兩項研究，充分驗證了博清生物科技（南京）有限公司研發生產的三氣培養箱在科研實驗中的重要作用和應用價值。在腫瘤細胞研究方面，博清生物科技（南京）有限公司研發生產的三氣培養箱能夠精準模擬低氧微環境，顯著影響腫瘤細胞的生長、遷移及相關基因和蛋白的表達，為腫瘤生物學研究提供了可靠的實驗條件。在厭氧微生物培養中，博清生物科技（南京）有限公司研發生產的三氣培養箱可有效創建穩定的厭氧環境，實現厭氧微生物的分離培養與鑒定，有助于挖掘厭氧微生物資源的潛在應用。實驗結果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發生產的三氣培養箱憑借其精確的氣體濃度調控、穩定的溫度和濕度控制，能夠滿足多種科研實驗需求，是開展生命科學研究的重要技術支撐。未來可進一步拓展三氣培養箱在其他特殊培養條件下的應用，探索其在更廣泛科研領域的潛在價值。